Профессор Сколтеха, микробиолог Константин Северинов о природе генных болезней, технологии редактирования генома и репарации ДНК
Среди огромного количества болезней людей есть определенный - и не очень широкий - класс так называемых генных болезней, которые сами по себе не связаны с заражением какой-либо бактерией или вирусом. Причина генных болезней в том, что мы получили от отца или матери – либо от обоих - копию гена, которая кодирует какой-нибудь белок с измененной функцией, что и приводит к развитию патологии. Типичным примером таких болезней являются, например, серповидно-клеточная анемия, различные талессемии, муковисцидоз и др. Медики прекрасно знают, какие именно изменения и в каких генах ответственны за эти так называемые «моногенные» болезни, вызванные изменением лишь в одном гене. В большинстве случаев генные болезни сродни приговору, в том смысле, что развитие болезни неотвратимо: ведь в отличие от, например, болезней, вызванных бактериальной инфекцией, ни антибиотик, ни какой-то другой препарат не сможет изменить физиологическое состояние, вызванное мутацией.
Константин Северинов. Фото: Sk.ru
Подход, который в таком случае хотелось бы применить, называется геномной медициной. В теории все очень просто: нужно изменить последовательность ДНК «плохой» копии гена и привести ее в норму, чтобы она стала такой же, как у здоровых людей. И в таком случае болезнь должна исчезнуть просто потому, что причины для нее больше не будет. В идеале такую процедуру хорошо бы проводить еще на стадии зачатия, когда мы существуем в виде одной-единственной клетки. Позже, когда речь идет о триллионах клеток, из которых состоит взрослый человек, исправить генетическую опечатку в каждой из многочисленных клеток какого-либо органа будет, скорее всего, невозможно.
Подходы, которые на практике позволят бороться с геномными болезнями, возникли совсем недавно и в настоящее время стремительно развиваются. Сам метод называется «геномным редактированием», и его появление связано с развитием технологии CRISPR-Cas. Эта технология пришла к нам из мира бактерий, которые используют CRISPR-Cas системы для борьбы с вирусами.
В ходе эволюции бактерии «придумали», как узнавать генетический материал вируса за счет комплементарного взаимодействия цепей нуклеиновых кислот, ДНК и РНК. Вообще, на принципе комплементарного взаимодействия построено все живое. Тот, кто любит философию, может вспомнить про инь и янь. В молекуле ДНК есть две цепи (знаменитая «двойная спираль»), которые подходят друг другу, как инь и янь. Каждая из цепей несет генетическую информацию в виде последовательности нуклеотидов. Если разделить эти две цепи, то по каждой из них, как по матрице, можно достроить недостающую цепь. Таким образом, у нас из одной двуцепочечной молекулы ДНК станет две, потом четыре и так далее. Именно таким образом происходит удвоение генетического материала при делении клетки.
CRISPR-Cas системы бактерий используют короткие молекулы нуклеиновой кислоты, так называемые CRISPR РНК, для того, чтобы очень точно, «в лицо», узнавать комплементарные участки ДНК вирусов. Узнаются участки длиной около 20 нуклеотидов, и само узнавание очень точное: необходимо полное соответствие последовательности CRISPR РНК и участка ДНК вируса. После того, как ДНК вируса опознана, то с помощью специальных Cas белков в вирусную ДНК в месте узнавания будет введен двуцепочечный разрыв. Таким образом, вирус будет инактивирован, а клетка - спасена.
Оказалось, что такой же процесс можно организовать и в клетках высших организмов, например, человека. Если взять Cas белок бактерии, ввести его в клетку млекопитающего, а затем в эту же клетку ввести CRISPR РНК, последовательность которой точно соответствует какой-то измененной копии человеческого гена, то этот участок будет опознан по принципу комплементарного узнавания. Затем, так же, как в случае инфекции бактерии вирусом, в копию гена, которая соответствует CRISPR РНК, будет внесен двуцепочечный разрыв, и ДНК разорвется — была одна длинная молекула ДНК, стало две. И что очень важно, разрыв произошел в строго определенном месте.
Почему хорошо уметь расщеплять ДНК в определенных местах? Понять это несложно. Каждый из нас содержит два набора генов — один от отца, другой от матери. Представьте себе ситуацию, что в копии гена, полученной от отца, есть мутация, которая приводит к какому-то генетическому заболеванию. При этом мамин ген совершенно нормальный. Так вот, если мы можем расщепить «неправильную» отцовскую копию в том месте, где произошла мутация, то клетка автоматически залечит разрыв, используя оставшуюся здоровую копию как шаблон. То есть, если плохая отцовская копия расщепилась, то по материнской хорошей копии можно все восстановить и у вас окажутся лишь две хорошие копии! Такой процесс залечивания разрывов ДНК носит название «репарация».
Именно на этом подходе основана геномная медицина: сначала вносим прецизионный разрыв в определенном месте гена, изменение которого привело к каким-то нежелательным последствиям, а потом в результате процесса репарации излечиваем разрыв, одновременно редактируя репарируемую последовательность. Очевидно, что центральную роль здесь играет CRISPR-Cas система, которая с помощью РНК-гида позволяет ввести разрыв в любое интересующее исследователя или медика место генома.
CRISPR-Cas системы и их роль в жизни бактерий были открыты в 2007 году. Первые статьи о том, что эти бактериальные системы защиты могут применяться для редактирования клеток высших организмов, появились в начале 2013 года. А уже в 2015 году стало известно, что сделаны первые попытки отъюстировать, подредактировать, чуть-чуть исправить человеческие эмбрионы.
Был проведен следующий опыт: использовали оплодотворенную человеческую яйцеклетку с мутацией, приводящей к болезни крови, которая называется бета-талассемия. Результатом этой болезни является анемия, недостаточный перенос кислорода красными клетками крови. От этой болезни страдают миллионы людей. В яйцеклетку был введен CRISPR РНК-гид, который должен был распознать неправильную копию гена, и белок Cas, чтобы ее раскусить и инициировать процесс репарации, т.е., излечивания. После «лечения» яйцеклеткам позволили расти в условиях лаборатории – недолго, до формирования очень раннего эмбриона, небольшого сгустка клеток. А потом посмотрели, что же стало с этими эмбрионами – удалось ли излечить мутацию, которая была в яйцеклетке? Хорошая новость заключалась в том, что некоторые эмбрионы действительно оказались излеченными: исходное изменение, ответственное за болезнь, исчезло. Если бы это из такого эмбриона вырос бы человек, он был бы здоров. Процент таких удачных исходов был не высок, но, очевидно, что технологию можно доработать и повысить вероятность успеха.
Плохая новость оказалась в том, что почти во всех клетках присутствовало большое количество дополнительных генетических изменений. Новые мутации возникли в самых разных участках генома и не имели никакого отношения к той болезни, от которой хотелось избавиться. В научных терминах это называется неспецифическая активность. К сожалению, это большая проблема, бороться с которой, по-видимому, будет очень сложно. Связана она с самой природой комплементарных взаимодействий: несмотря на то, что в целом узнавание CRISPR РНК ДНК-мишени очень точное, в огромном (по бактериальным меркам) геноме высших организмов всегда найдутся очень похожие последовательности, которые тоже будут узнаваться CRISPR-Cas системой, пусть и с меньшей эффективностью. Но зато таких не вполне совпадающих последовательностей может быть много. И они тоже будут расщепляться, вызывая процессы репарации в нежелательных местах, что будет приводить к повышенной частоте возникновения мутаций.
Колонка основана на лекции профессора Северинова на сайте «Постнаука»